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三分钟带你了解当前最热的基因编辑技术

  基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来,就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势武汉较好的癫痫医院,技术不断改进后,更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。基因编辑是一种遗传工程技术,针对某个序列已知但功能未知的序列,通过改变生物的遗传基因,使其特定的基因功能丧失作用,通过研究对生物体造成的影响,进而推测出该基因的生物学功能。本文为你科普基因编辑三大技术:

  基因敲除

  进行DNA水平编辑。一般用于构建基因敲除鼠模型。

  CRISPR/Cas9:CRISPR/Cas9系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系鄂州癫痫病公立医院统,通过RNA介导特异性的切割外源遗传物质,用以对抗入侵的病毒和质粒。使用Cas9切口酶和一对sgRNA,两个相近的切口造成DNA双链断裂,诱导细胞发生非同源末端连接修复,造成目的基因的突变。

  CRISPR/Cas9技术自问世以来,取代“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN),成为科研、医疗等领域的有效工具”.一般通过体外转录得到sgRNA与cas9的mRNA,通过注射到原核期受精卵内,移植到假孕母鼠体内获得基因编辑的小鼠进行基因功能研究。

  构建方法:

  确定待敲除基因的靶位点。

  设计识别靶位点的识别的一对sgRNA。

  构建可表达sgRNA的Cas9质粒。

  体外转录sgRNA 和Cas9 RNA。

  将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性。

  将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。

  将Founder自交得到F1代。

  适用范围:

  制备敲除鼠,利用敲除鼠进行基因功能的研究;进行细胞水平敲除基因时,可以选择慢病毒载体,构建lenticrispr-v2质粒,通过包装病毒进行细胞水平敲除。

  基因敲减

  RNA水平,是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA,达到阻止基因表达的作用。一般用于细胞水平敲减基因。

  (1)RNA干扰:

  是siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物RISC。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在郑州羊角风治疗医院哪家好距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默,是一种特异性的转录后基因沉默。

  一般合成针对靶基因的siRNA,通过转染的方法使之进入细胞内,使靶基因沉默。这一方法受转染效率的影响较大。目前有不少基因的siRNA已经有商业产品,所以使用时买来就可以了,比较方便。

  适用范围:

  一般通过公司合成后,通过转染细胞进行细胞水平敲减。

  (2)shRNA:

  “短发夹RNA”,shRNA包括两个短反向重复序列,中间由一茎环(loop)序列分隔的,组成发夹结构,由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

  构建shRNA的病毒表达载体,常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等,机制与质粒载体相似,利用了病毒感染细胞效率比较高的特点,解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。

  构建方法:

  shRNA设计:设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。

  载体构建:可根据实验需求选择慢病毒、腺病毒载体。

  转染细胞:常用的方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等

  观测GFP 荧光和稳定表达细胞系筛选:可用于带有GFP标签的质粒载体。

  检测RNA 干周口的癫痫医院在哪里扰效率:可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。

  适用范围:

  一般通过构建慢病毒、腺病毒等进行细胞水平敲减。


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